Экология растительных алкалоидов в культуре клеток in vitro

Биотехнологическое направление разработки способов получения растительных биологически активных веществ является наиболее перспективным, что объясняется, помимо технологического аспекта, соображениями экологического плана – многие растения-продуценты БАВ являются редкими и эндемичными.

Методическая база биотехнологии лекарственных растений значительно обогатилась за последние годы за счет разработки таких методов, как использование иммобилизованных растительных клеток и ферментов. Однако традиционные методы поверхностного и глубинного культивирования растительных клеток остаются основой биотехнологии растений. Ждут решения такие проблемы. как генетическая гетерогенность клеток in vitro, нестабильность штаммов-проодуцентов и высокая себестоимость биотехнологического производства. Достаточно редки примеры отсутствия зависимости продуктивности растительных штаммов от органного происхождения.

Отдельного упоминания заслуживает направление, связанное с использованием растительных клеток и бесклеточных систем для получения БАВ из веществ-предшественников. Классический пример – использование бесклеточного экстракта некоторых растений для получения фарнезола и бизаболена из мевалоновой кислоты, а также возможность взаимного перехода различных изомерных форм фарнезола.

Стратегия расширенного производства остродефицитных лекарственных средств биотехнологическими методами основывается на разработке количественных подходов к выращиванию растительного сырья in vitro. Концепция развития, в соответствии с утвержденной нормативной документацией, определяющая порядок описания технологии культивирования, результатов аналогичных исследований может быть представлена регламентом производства биотехнологических продуктов. При этом, ограниченная продуктивность штаммов, их физиолого-генетическая лабильность остаются лимитирующим фактором эффективности производства. Актуальность биотехнологической разработки в том, чтобы получать растительные алкалоиды в оптимизированных условиях лимитирующих факторов при культивировании.

При выборе экспланта необходимо учитывать, что различные части одного и того же растения могут отличаться между собой качественным и количественным содержанием алкалоидов, то есть, в различных вегетативных и генеративных частях могут находиться разные алкалоиды. Для примера рассмотрим корень мачка бахромчатого, который содержит исключительно хелеретрин и сангвинарин, тогда как в надземных его частях находятся только протопин, коридин и аллокриптопин. Поэтому, при изучении новых растений необходимо отдельно исследовать различные части. Кроме того, как процентное содержание, так и качественный состав алкалоидной смеси могут меняться в течение года, в зависимости от стадий развития растений.

Морфологическая характеристика Anabasis aphylla L.

Представители семейства Chenopodiaceae Less. ассоциируются со злостными садово-огородными сорняками и рудеральными растениями. И это соответствует действительности: виды анабазис безлистный (Anabasis aphylla L.), мари (Chenopodium) и лебеда (Atriplex) распространились как сорняки-космополиты. Но, вместе с тем, этому семейству человечество обязано корнеплодом первостепенной важности - свеклой и, прежде всего, сахарной свеклой, которая ныне дает более трети всего производимого в мире пищевого сахара, а также повседневным овощем - столовой свеклой.

Фенотипческие признаки семейства Chenopodiaceae Less - невзрачные растения: среди них почти нет декоративных видов, введенных в культуру. Это однолетние и многолетние травы, полукустарники и кустарники и, даже, небольшие деревья. Цветы мелкие, малозаметные, зеленые или желтые, одиночные или, чаще, в малоцветковых клубочках. Соцветия колосовидные, кистевидные или метельчатые.

Ботаническая характеристика анабазиса безлистного - A. aphylla L. содержит информацию, что это - cуккулентный полукустарник с сильно ветвистым стеблем в нижней части и травянистый - в верхней. Ветки членисты, высотой 25-75 см. Растет приплюснуто-шаровидным кустом 55-60 см (до 140 см) в диаметре. Корневище толстое, искривленное, деревянистое, переходящее в мощный главный корень, который часто проникает до глубины залегания грунтовых вод (5-20 м). Корневая система стержневая. Листья имеют вид слабовыступающих треугольных чешуй, срастающихся попарно в короткие влагалища. Цветки мелкие, сидящие поодиночке в пазухах прицветников и собранные в колосовидное соцветие. Плоды сплюснутые, ягодообразные. Растение ядовито.

Маревые распространены по всему земному шару, от полярной зоны до тропиков. Область распространения A. aphylla L. охватывает огромную территорию СНГ, причем границы произрастания его, в общем, совпадают с границами полупустынной и пустынной зон. Произрастает по солончаковым и глинистым степям и полупустыням. Встречается в степной зоне северной половины Краснодарского края.

A. aphylla L. - восточносредиземноморский вид, проникающий на восток до Монгольского Алтая. Произрастает на равнинной территории Казахстана, в республиках Средней Азии, Азербайджане и юго-восточных районах европейской части России. Основные районы промышленной заготовки - Южно-Казахстанская, Джамбульская и Кзыл-Ординская области.

Это растение равнин и низких предгорий, не поднимающееся в горы выше 400 м над уровнем моря. Произрастает на глинистых и суглинистых засоленных почвах пустынь и полупустынь, на такырах, сероземах, солонцах, реже на солончаках. Положительно реагирует на рыхление почвы и грунтов, о чем можно судить по обильному и пышному разрастанию A. aphylla L. на перепаханных площадях и выбросах из нор грызунов. На песчаных почвах не встречается, но на такырах легко переносит неглубокое засыпание песком.

Выбор растительного объекта для использования в качестве экспериментальной модели, в процессе культивирования in vitro и последующего получения штамма-продуцента БАВ, как правило, связан с информацией о его химическом составе и успехами выращивания в условиях in vivo. Растения семейства Chenopodiaceae Less. широко используются в прикладной медицине и являются стратегически важным материалом в биотехнологических лабораториях всего мира как источник БАВ (эфирные масла, пиперидиновые алкалоиды, сапонины, сальсолин, сальсолидин и др.).

Алкалоиды анабазин и лупинин синтезируются A. aphylla L. Они являются главной частью оснований технического анабазин-сульфата, который вырабатывается Чимкентским химико - фармацевтическим заводом - как средство борьбы с сельскохозяйственными вредителями. Анабазин и лупинин - доступные исходные продукты для разнообразных синтезов. Неодревесневшие зеленые побеги (трава) A. aphylla содержат 2,0-4,0% (до 12,0%) алкалоидов: анабазин, афиллин, афиллидин, лупунин, оксиафиллин, оксиафиллидин и др.

Главным из алкалоидов является анабазин - бесцветная густая жидкость, легко растворим в воде и обычных органических растворителях, дает кристаллические соли с минеральными и органическими кислотами. В растении находится преимущественно в виде щавелевокислой соли. Содержание анабазина в сумме алкалоидов составляет 60,0%, варьируя от 5,0 до 95,0%.

В сырье анабазина содержится 1,7-2,0%, иногда до 7,0%. К осени содержание анабазина по мере одревеснения черенков снижается, но остается еще довольно высоким, вплоть до заморозков. Ядовитость растения обусловлена наличием в нем анабазина. Все алкалоиды A. aphylla хорошо растворимы в воде, органических растворителях. Кроме того, в анабазине содержатся органические кислоты (от 13 до 26%), в том числе щавелевая (7-17%), пектиновые вещества (17-20%). Растение богато золой (до 20%), в которой содержится 14% калия, 16% натрия, много редких элементов.

Алкалоид анабазин обладает сильным инсектицидом контактного действия. В виде водных растворов (анабазин сульфата) или дуста он используется против различных насекомых вредителей сельскохозяйственных культур. Применение анабазина в быту ограничено, из-за его высокой токсичности и способности проникать через неповрежденную кожу и слизистые. По фармакологическим свойствам анабазин близок к никотину, цитизину и лобелину и относится к группе ганглионарных ядов. В малых дозах он возбуждает центральную нервную систему, рефлекторно усиливает дыхание, повышает артериальное давление, возбуждает ганглии вегетативной нервной системы. В больших дозах оказывает угнетающее и парализующее действие. В лечебных целях анабазин применяется, как действующее вещество для получения никотиновой кислоты. Лупинин в чистом виде не применяется, служит сырьем для получения хлористо-водородного лупикаина, применяющегося в качестве средства для местной анестезии. Анестезирующее действие хлористо-водородного лупикаина значительно превосходит действие кокаина и новокаина. Анабазин может служить сырьем для получения никотиновой кислоты. Применяется также для лечения вшивости и стригущего лишая у животных. Для борьбы с вредителями сельского хозяйства применяется анабазин-сульфат, содержащий, кроме анабазина, и другие алкалоиды.

Часто растения, стоящие близко одно к другому в системе ботанической классификации, заключают в себе ряд алкалоидов, весьма близких по своему строению и образующих естественную группу. Что нельзя сказать о представителях семейства Chenopodiaceae Less. - спектр алкалоидов разнообразен по химическому и биологическому действию. Большинство видов относится к южным (неморальной, лесостепной и степной) и полизонально широтным группам, что свидетельствует о малой роли эколого-географических факторов в распространении единообразных алкалоидов среди растений.

Но известны случаи, когда из двух весьма близких между собой ботанических видов один богат алкалоидами, а другой - или совершенно их не содержит, или же, содержит алкалоиды другого строения. Например, листья лебеды (Artipleks patula L.) содержат сапонины, в плодах, цветах и листьях солянки Рихтера (Salsola Richteri Kar.) алкалоиды - сальсолин и сальсолидин (0,7-1,4%), ясменник душистый (Asperula odorata L.) - кумарин. Морфологическая однородность семейства Chenopodiaceae Less, не свидетельствует о биохимическом сродстве синтезируемых веществ. В спектре химических веществ встречаются: пиперидиновые алкалоиды (анабазин), кумарин, сапонины и другие.

Таким образом, утверждать, что алкалоиды являются характерными и специфичными для определенных ботанических семейств или даже видов, и не встречаются ни в каких других растениях, ошибочно. Однако, по мере рассмотрения этого вопроса, выявился ряд случаев, когда один и тот же алкалоид был найден в растениях, стоящих очень далеко одно от другого в ботанической классификации и принадлежащих к совершенно разным семействам. Пиперидиновые алкалоиды представляют собой большую и широко распространенную в растительном мире группу соединений, объединяемых на основе общности строения и единства путей биосинтеза. Поскольку число таких случаев довольно велико, их нельзя считать исключениями, и не может идти речи о строгой ботанической специфичности химических веществ в частности алкалоидов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Концепция научной и научно-технической политики РК. Постановление Правительства РК от 12 июля 2000 года № 1059. Собрание актов Президента РК и Правительства РК. - 2000. - №29. - С.100.

2. «О внесении изменений и дополнений в постановлении Правительства РК от 26 июня 2001 года №871 и от 24 июля 2001 года №996». Собрание актов Президента РК и Правительства РК от 1.04.2003 № 315.-С.-298-330.

3. Газалиев А.М., Журинов М.Ж., Фазылов С.Д. Новые биоактивные производные алкалоидов. - Алма-Ата, 1992. – С.125.

4. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М: Наука, 1964. – С.- 795 – 802.

5. Каранова С.Л., Носов А.М., Пауков В.Н. и др. Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1986. - С. 83-87.

6. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. - М.: Мир, 1979. – С.548.

7. Пасешниченко В.А. Новый альтернативный путь биосинтеза изопреноидов у бактерий и растений // Биотехнология,1998. - Т.63, №2. - С.171-182.

8. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. - Алматы: Конжык, 1996. – С.271.

9. Клыков С.П., Дербышев В.В. Оптимизация микробиологического синтеза // Биотехнология, 2001. - №2. - С.(стран)

10. Клыков С.П., Дербышев В.В. Связь возрастной структуры биомассы с клеточными синтезами. - М.: Компания Спутник, 2003. – С.48.

11. Огородникова У.Б., Шаушеков З.К., Короткова А.В. // Биология культивируемых клеток растений и биотехнология. - Алматы. - 1993. - Т.2. - С.188.

12. Кунаева Р.А., Сапко О.А. Мападилова А.М. Биологически активные вещества растений Казахстана // Биотехнология.Теория и практика. - 1997. - №3. -С.77.

13. Smith R.J. Synthesis of taxanes in culture using pseudocallus cells. USA patent 5344775, C12 N005/00. - 1994. – Р.-460.

14. Носов А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991. - С. 5-18.

15. Pestchanker L.J., Kurina M., Genlichte A.M. et al. Production of dihydroleucodin from callus lines of Artemisia douglassiana Besser // Biotechnology Letters. - 1989. - Vol.11. №11. - Р. 803-806.

16. Tetsuo K., Yoshimi O., Masaki S. et al. In vitro conversion of 2,3-oxidosqualene into dammarenediol bhy Panax ginseng microsomes // Biol. and Pharm. Bull. - 1997. - Vol.20, №3. - Р. 292-294.

17. Carreras C.R., Rodriguez J., Silva H.J. et al. Hydroxilation of sodic grindelate by Cunninghamella echinulata // Phytochemistry. - 1996. - Vol.41, №2. - Р.473-475.

18. Allison A.J., Butcher D.N., Connoly J.D. et al. Paniculides A, B and C: bisabolenoid lactones from tissue cultures of Andrographis paniculata // Chemical Commun. - 1968. - Р. 1493.